1、体格检查：检查全身发育状况，有无畸形，包括智力、身高、体重，第二性征发育情况，有无体格发育畸形，双眼眼距是否增宽，甲状腺有无肿，有无颈蹼，乳房有无溢乳，皮肤色泽及毛发分布。测量体重、身高，四肢与躯干比例，五官特征。妇科检查应注意内外生殖器发育，有无先天缺陷、畸形，其中第二性征检查有助于鉴别原发性闭经的病因，缺乏女性第二性征提示从未受过雌激素剌激。
2、功能试验：包括药物撤退试验以及垂体兴奋试验，药物撤退试验用于评估体内雌激素水平，以确定闭经程度。药物撤退性试验包括孕激素试验、雌孕激素序贯试验及孕激素试验，垂体兴奋试验是为了了解垂体对GnRH的反应性。
3、激素测定：建议停用雌孕激素药物至少2周后行激素测定，以协助诊断。包括血甾体激素测定、催乳素及垂体促性腺激素测定，肥胖、多毛、痤疮患者还需行胰岛素、雄激素等测定。
4、影像学检查：
（1）盆腔超声检查：观察盆腔有无子宫，子宫形态、大小及内膜厚度，卵巢大小、形态、卵泡数目等。
（2）CT或磁共振显像：用于盆腔及头部蝶鞍区检查，了解盆腔肿块和中枢神经系统病变性质，诊断卵巢肿瘤、下丘脑病变、垂体微腺瘤、空蝶鞍等。
（3）静脉肾盂造影：怀疑米勒管发育不全综合征时，用以确定有无肾脏畸形。
5、染色体检查：对原发性闭经病因诊断及鉴别性腺发育不全病因，指导临床处理有重要意义。
6、其他检查：如靶器官反应检查，包括基础体温测定，怀疑结核或血吸虫病，应行相应检查。
7、促性腺激素测定：了解垂体机能，其中又以FSH意义较大。FSH 水平升高可协助诊断原发性卵巢功能衰竭，如LH水平升高，但无周期性波动时，可能为多囊性卵巢综合征。又如生长激素对诊断侏儒症、PRL对诊断溢乳症(lactorrhea)均有重要意义。促性腺激素水平正常或降低者，应考虑中枢神经系统及垂体肿瘤。
8、垂体兴奋试验：鉴别垂体及垂体以上的病变。快速静脉注入LH-RH100μg，注射前15分钟及注射后45分钟各测定血清FSH及LH水平，水平上升者，说明垂体功能正常，病变属中枢性，反之，则病变在垂体。本试验需反复进行，才能作出判断。
9、染色体及染色质检查：原发性闭经多见于染色体异常者，因此，原发性闭经及促性腺激素水平增高者，无论有无男性化表现，应常规检查染色体核型。在检查性染色体前，可先作性染色质检查，如<6%～10%者，再作染色体检查。