检查包括支原体的分离培养、支原体抗原及核酸成分、血清中的支原体抗体检测。支原体的分离培养是根据病人的性别、年龄，以及病情不同，在无菌条件下男性常取尿道分泌物，初段尿沉渣、精液、前列腺液等进行病原学的培养。
由于支原体不耐干燥，标本采集后应尽快送检，及时接种，以免影响到检测。支原体的抗原培养，包括免疫荧光试验、免疫酶试验，以及免疫结合试验。支原体的核酸检测，包括DNA探针技术、PCR检测法。血清的支原体抗体检测，是为诊断支原体感染提供血清学依据，但是有些无症状者可因携带支原体，而存在低滴度的抗体。因此，也有人认为，血清抗体检查在常规实验室检查中用处不大。目前常用的检测方法，包括代谢抑制试验和ELISA法。