青霉素属于β-内酰胺类的抗菌素，主要作用是针对敏感菌的抗感染治疗。其中抗菌谱包括有革兰氏阳性菌以及少数的革兰氏阴性球菌，对革兰氏阴性杆菌几乎无效。临床中主要用于治疗的常见疾病，包括有皮肤的感染、急性的支气管炎、细菌性肺炎，以及部分的脑膜炎。
另外，还对回归热、钩体病、炭疽、破伤风这些疾病都有一定的效果。对于长效的青霉素，例如苄星青霉素还可以用于治疗梅毒。在使用青霉素之前，必须进行药物的过敏试验，因为部分的患者对青霉素过敏，在使用以后可能会引起严重的感染性休克。