5-核苷酸酶增高主要见于肝胆系统疾病，如阻塞性黄疸、原发性及继发性肝癌、肝内结石、胆管癌、胆管炎、胰腺癌、肝内胆汁淤积、药物性肝损害、急性肝炎、活动性慢性肝炎、肝硬化、原发性胆汁性肝硬化、传染性单核细胞增多症等。
血清5-核苷酸酶出现升高，还可以见于某些骨骼疾病，这需要结合碱性磷酸酶来进行判断。如果碱性磷酸酶和5-核苷酸酶同时升高，可确认是肝胆疾病所致，如果碱性磷酸酶升高而5-核苷酸酶不升高，这可能是其他疾病，像骨骼疾病等。